肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

日期: 2019-07-18
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 MBCN 德国美天旎生物 前天

如何构建肿瘤微环境 (tumour microenvironment, TME)研究肿瘤异质性癌症进展与后续转移、药物反应和耐药,一直是癌症研究中巨大的挑战。目前已有人源肿瘤组织来源移植瘤模型(patient-derived xenografts, PDX);PDX最大的优势,保留了肿瘤异质性,相对于传统人源肿瘤细胞系更符合临床肿瘤特征。


然而PDX动物模式移植成功率低、培养周期长和成本高等缺点使其难以大规模应用于临床。随着干细胞生物学的发展,体外3D细胞培养分化成可模拟体内器官空间形态结构的类器官(organoid),亦可应用于新的人类癌症模型的开发。

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

直径3mm大小的中脑类器官 (midbrain organoid)。Adapted from A*STAR News: Singapore scientists grow mini human brains.


类器官可自成体组织干细胞或多能干细胞生成。作为传统2D细胞培养和动物模型之间的桥梁,类器官具有多种优势,提供了实验可操作性和再现生物体复杂性。以下比较了此三种实验模式在生物研究中的优缺点。

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

Adapted from N Engl J Med. 2019;380(6):569-579.


患者衍生的类器官(Patient-derived organoids, PDOs)或称肿瘤类器官为取自患病者体内原发性肿瘤,在实验室中培养出一微型的3D肿瘤细胞模型。首先,从患者体内获取肿瘤组织,清洗以防止污染,经消化、分散、过滤、离心后分离出肿瘤细胞 (方法可参考 Miltenyi Biotec,Tumor Dissociation Kit, human & Tumor Cell Isolation Kit, human, human)。然后,选择合适的生物材料作为3D培养的细胞外基质,通过模拟肿瘤细胞基质环境进行培植。最后,形成体外类器官模型。肿瘤类器官高度概括了来源肿瘤组织的特征,保留了个体之间的肿瘤异质性,可用于功能性的测试如进行高通量的药物筛选,甚至个体化治疗。


类器官模型在肿瘤研究中的独特优势

高度保留原位肿瘤组织的生物特征和异质性;

多次传代后依然能保持基因组稳定性;

培养周期短;

成本低。



肿瘤类器官(PDO)的多方面应用

临床应用方面,肿瘤类器官可以用于化疗药、靶向药、新型抗肿瘤抗体药等药物敏感性检测,辅助临床治疗决策,有效优化医疗资源配置。对患者而言,通过PDO药敏检测技术,在疾病的各个阶段,均可快速检测出最适合患者的药物治疗方案,降低药物毒性副作用、耐药风险和肿瘤复发几率。


生物医药科研方面,肿瘤类器官具备肿瘤异质性,与来源肿瘤组织的基因表达完全一致,堪称「培养皿中的微器官」。在疾病模型、肿瘤分子、再生医学、与精准医学研究等多方向均有广泛的应用前景。


新药研发方面,肿瘤类器官可作为最佳的体外试验模型,可大幅度缩短临床前试验与临床试验的周期、降低新药开发成本与风险,提供新药开发临床前大量生物数据的支持,为新药研发提供最优质的平台。

 肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

目前可建立的类器官模型与应用

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor Infiltrating Lymphocytes, TILs)为肿瘤微环境的一个重要组成部份,由不同淋巴细胞组成的异质群体,包括T 细胞、B 细胞、natural killer (NK) 细胞、巨噬细胞及其他各种免疫细胞。关于他们在肿瘤生长和进展中的作用,几十年来科学家们一直争论不休。但不可否认的是这群细胞TILs癌症进展中发挥了关键的作用,甚至可作为一种治疗手段。因此,TILs的表型与功能特征,与肿瘤细胞或肿瘤间质的相互作用,以及他们在预后或预测中的意义,都已成为全球研究热点。

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

TILs 在肿瘤组织中的复杂作用


而如今肿瘤类器官,相对于模式动物,体外培养环境相对单纯;需要人工重建才能恢复肿瘤微环境(tumour microenvironment, TME)。美国斯坦福大学的Calvin J. Kuo研究组,在Cell杂志上发表了Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment的论文,通过气液交互法(air-liquid interface,ALI)培养患者来源的肿瘤类器官(Patient-derived Organoids,PDOs)重现了患者肿瘤免疫微环境。

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

Cell.2018;175(7):1972-1988.


ALI-PDO该技术特点在于通过一体培养,保留了原位的肿瘤实质(parenchyma)、基质(stroma),同时包含功能化的肿瘤特异性的肿瘤浸润淋巴细胞群 (TILs)。进而还原了其他类器官模型中没有的肿瘤组织原位基质和具有免疫检查点封锁(Checkpoint Blockade)的肿瘤微环境内源免疫细胞群。当与免疫细胞和成纤维细胞混合在一起时,肿瘤类器官就可变成肿瘤微环境的模型,这大大助益于在癌症研究与抗癌药物研发。

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

ALI-PDOs 模型成功保留了原肿瘤组织中固有的纤维基质和多样的免疫细胞组分,并从基因水平上得到佐证。而且,PDOs 中的 TILs 准确保留了原始肿瘤中的 T 细胞受体(TCR)谱。


美天旎在异种移植瘤(xenograft tumors)或肿瘤类器官(PDO)呈现的肿瘤微环境研究提供高效富集肿瘤浸润淋巴细胞 (TILs)实验方案

1.制备人异种移植瘤单细胞悬浮液(Generation of single-cell suspensions from human xenograft tumors)

方法可参考Miltenyi Biotec,Tumor Dissociation Kit, human 


2.自肿瘤细胞群中分离TILs (Isolation of TILs from dissociated tumor tissues)

CD45(TIL)磁珠专门用于从分离的肿瘤组织中的TILs。

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

肿瘤类器官(PDOs)重现患者肿瘤免疫微环境!

使用CD45 (TIL)磁珠分离肿瘤组织中的TILs。经分离后,TILs族群纯度可达90%


3. 分离后的TILs即可进行下游分析 (Downstream Analysis of Isolated TILs)

通过细胞族群分析与单细胞测序,能够还原肿瘤组织中的T,B和NK细胞,并进一步验证肿瘤浸润免疫细胞能够还原原位肿瘤中的TCR全部位点,可供选择治疗手段和预后方面提供潜在的指引。


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