Nat Chem Biol | 利用CRISPR-Cas9实现位点特异性RNA m6A编辑

日期: 2019-08-08
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本文转载自BioArt

撰文 | 章台柳

责编 | 兮


真核细胞中,m6A是最多的RNA修饰形式。核心亚基METTL3、METTL14、WTAP和其他蛋白KIAA1429、RBM15组成甲基转移酶【1】,即m6A‘writer’,识别序列RRACH,催化形成m6A。FTO、ALKBH5介导m6A的去甲基化【2,3】。m6A的功能性研究目前已经取得巨大的进步,但是mRNA特定位点甲基化的功能还不清楚。实际上,m6A在mRNA上的分布并不均匀,大部分的甲基化集中在终止密码附近【4】,在5’UTR和起始密码子也有m6A的峰。对于m6A的研究主要基于对修饰酶的干扰,导致对整体RNA甲基化的影响;或者对甲基化位点进行突变研究m6A的区域性功能,但核苷酸序列的改变可能引入无法预期的特性,使数据的解读变得复杂。目前的研究工具不能区分单个的m6A修饰的功能。


CRISPR-Cas9技术发展迅速,已经实现精确的基因组编辑功能,包括靶向的DNA切割/修复、直接的碱基编辑以及位点特异的表观基因组编辑。通过将催化部位失活的Cas9(dCas9)与DNA或组蛋白修饰酶融合,gRNA招募Cas蛋白到特异的位点,实现表观基因组的编辑。同样的思路,如果将RNA碱基修饰酶与Cas蛋白相融合,或许将实现位点特异的RNA修饰编辑。


2019年8月5日,美国康奈尔大学的Shu-Bing Qian团队在Nature Chemical Biology上发表了题为 Programmable RNA N6-methyladenosine editing by CRISPR-Cas9 conjugates 的文章,报道了在RNA上进行m6A修饰的写入和擦除的新工具,通过融合CRISPR-dCas9和m6A甲基转移酶实现对mRNA的3’UTR和5’UTR区域的单个位点的m6A特异性写入;通过融合CRISPR-dCas9和ALKBH5或FTO实现对RNA位点特异性的去甲基化。


Nat Chem Biol | 利用CRISPR-Cas9实现位点特异性RNA m6A编辑


结构学分析显示甲基转移酶中METTL3是催化核心,METTL14是RNA结合平台。METTL3-METTL14异源二聚体具备强烈的催化活性。研究人员构建了M3M14-dCas9和催化核心失活的M3D395AM14-dCas9融合蛋白,在人源HEK293T和鼠源MEF中表达,发现两个融合蛋白主要定位在细胞质中,与内源的METTL3、METTL14定位在细胞核中不同。虽然生理上m6A修饰写入发生在新生RNA(nascent RNAs)转录过程中,但细胞质内的m6A写入工具为研究成熟RNA的de novo甲基化功能提供了可能。与DNA靶向dCas9类似,sgRNA和PAMer结构对于M3M14-dCas9与靶标RNA结合是必需的。研究人员首先选取Hsp70Hspa1amRNA的5’UTR检测M3M14-dCas9是否能够写入m6A修饰。在基本不表达Hspa1a的MEF细胞中引入携带Hspa1a 5’UTR的荧光素酶报告系统,检测发现在5’UTR的A103位点有本底性m6A修饰。引入M3M14-dCas9和sgRNA、PAMer导致A103位点的m6A增加,而且m6A的写入具有位点特异性(在A1280没有m6A增加)和甲基化酶催化活性依赖(M3D395AM14-dCas9不能增加A103的m6A)。5’UTR对核糖体扫描(ribosome scanning)非常重要。之前的研究表明CRISPR-Cas9靶向5’UTR或编码区将会抑制mRNA翻译过程【5】,而检测发现单独表达sgRNA或PAMer,抑或是与M3M14-dCas9共表达均不影响核糖体扫描过程。相反,在应激条件下,5’UTR甲基化导致Fluc活性增加,而mRNA水平不变,即当帽子依赖性的转录机制被抑制时,5’UTR m6A促进非经典的转录过程。同时5’UTR m6A对mRNA的降解和半衰期没有影响。但是,研究显示3’UTR m6A修饰的增加,显著降低mRNA的半衰期。



Nat Chem Biol | 利用CRISPR-Cas9实现位点特异性RNA m6A编辑



FTO和ALKBH5是m6A去甲基化酶,依靠识别m6A的构象上标志发挥作用。研究人员分别构建了ALKBH5-dCas9、FTO-dCas9以及相应失活突变体,表达后发现融合蛋白主要定位于细胞核内,而且没有改变整体的m6A状况。Malat1是细胞中含量丰富的lnc-RNA,在A2577位点具有高程度的甲基化。研究人员利用sgRNA靶向A2577位点,ALKBH5-dCas9、FTO-dCas9显著降低甲基化。这种去甲基化具有酶活性依赖和位点特异性。并证明A2577位点的m6A促进Malat1的U-tract与HNRNPC蛋白结合,而去甲基化导致HNRNPC蛋白的解离。所以m6A编辑能够重塑RNA的结构,调控RNA和RNA结合蛋白之间的相互作用。


Nat Chem Biol | 利用CRISPR-Cas9实现位点特异性RNA m6A编辑


总之,研究发展了位点特异性的m6A写入和擦除工具,在不改变核苷酸序列和整体m6A状态的情况下对RNA甲基化进行编辑,为研究表观转录组学提供了新工具。



原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41589-019-0327-1




参考文献




1. Liu, J. et al. A METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation. Nat. Chem. Biol. 10, 93–95 (2014). 

2. Jia, G. et al. N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nat. Chem. Biol. 7, 885–887 (2011). 

3. Zheng, G. et al. ALKBH5 is a mammalian RNA demethylase that impacts RNA metabolism and mouse fertility. Mol. Cell 49, 18–29 (2013). 

4. Meyer, K. D. et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell 149, 1635–1646 (2012).

5. Liu, Y. et al. Targeting cellular mRNAs translation by CRISPR-Cas9. Sci. Rep. 6, 29652 (2016).


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